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自从第一个皮下注射液上市以来，注射热很可能是注射的结果。现在，人们将引起恒温动物体温异常升高（发烧、休克或死亡等）的致热物质，称为热原，可能是造成大多数早期发烧和肠外注射描述的其他附带生物效应的原因。热原包括内毒素和非内毒素热原(NEP)，细菌内毒素是最常见的热原，也是医药工业界安全生产所关心的问题。注射时，即使是微量的热原，也会通过称为Toll样受体(TLR)的一类蛋白质触发先天免疫反应。TLR是跨膜蛋白，主要在巨噬细胞和树突状细胞等所谓的前哨细胞中表达，它们在先天免疫系统的激活中起着至关重要的作用。它们充当模式识别受体，由对微生物或病原体相关分子模式以及内源性损伤相关分子模式的识别触发。迄今为止，已知13种人类TLR，每一种都充当一种或几种特定配体的受体。这种结合触发了细胞内信号级联反应，作为对潜在有害微生物或其他外源性物质的第一反应的基础（图1）。

兔热原测试(RPT)于1942年推出，是第一个也是唯一一个用于检测药物和医疗产品中热原的体内方法，到目前为止，非肠道给药的产品一般都以这种方式进行测试。RPT存在各种限制，例如：无法区分不同的内毒素和NEP；对疫苗等固有致热药物的反应只能定性；无法应用于非静脉内给药的药物；动物饲养和用于测试所需要投入较多时间和精力；而且最重要的是无法定量分析。

基于鲎变形细胞裂解物（LAL）的内毒素检测于1977年被美国FDA批准，之后几年陆续被其他主流药典批准。在药物质量控制中，有三种主要的LAL方法用于检测和/或定量内毒素，根据它们的检测机制命名。虽然它们是不同的方法，但它们都利用鲎试剂来检测内毒素，并依赖于相同的凝血级联原理（图2）。凝胶法是最原始的鲎试验，也是目前药典认可内毒素检测的“金标准”。这是一种定性检测方法，其中凝胶的凝结表明样品中存在高于裂解物灵敏度的内毒素。其他两种方法，比浊法和显色法，都是通过标准曲线实现定量分析。比浊法LAL测试将凝胶化速率（浊度）联系起来，以确定样品的内毒素浓度。显色LAL测试使用一种合成显色底物，该底物添加到试剂中并被凝血酶激活，从而产生比色读数。

LAL采用海鲎血液作为生产原料，由于季节、地域等差异，使得LAL的批次差异成为常见现象。LAL还含有许多其他蛋白质（其中至少十种参与抗微生物反应），这些蛋白质可以抑制或增强活性，例如通过检测β-葡聚糖和纤维素残基激活LAL级联的G因子蛋白。然而，LAL方法的主要限制与其来源有关。该过程需要对动物鲎进行放血，即使通过采集少量血液便放生和标记，这一过程对动物来说也并非没有风险，据统计死亡率可高达30%以上。除了立法也有明显的伦理问题外，还有许多关于这些生物的长期生存能力的问题，以及由于它们的数量减少导致的环境问题。

第一个市售的基于重组因子C(rFC)的内毒素检测方法（BET）于2004年面世（图2）。从那时起，其他rFC试剂也逐步进入市场，以提高可用性以及产品和供应商的范围。rFC检测使用单一重组蛋白，因子C和小荧光肽作为检测试剂的一部分。与其他重组生产的产品一样，其生产标准化主要为控制生产相同的rFC蛋白，并且已有实验证明rFC比LAL批次间的可重复性高（表1)。另外，rFC检测也不包含因子G，因此，它可以避免葡聚糖引起的G因子非特异性干扰所造成的假阳性。

由于潜在的干扰，蛋白质样品中内毒素的检测可能具有挑战性。辉瑞公司2013年利用所有市售鲎试剂测试方法（凝胶法、动力学比浊法、动力学显色和终点显色）以及rFC检测了13个具有代表性的生物蛋白质样品（图3）。在所有定量分析中，10个样品的内毒素水平都可测量，rFC和LAL之间的检测结果差异不大。

裴宇盛等人进行了rFC产品的适用性。在四个实验室的每一个都测试了三批六种不同药品的适用性和干扰性。六个具有代表性的品种为：抗生素、生化药物、重组原药、中药注射剂、病毒疫苗和单克隆抗体。研究得出的结论是，rFC对六种药品具有良好的适用性；所有18批次的加标回收率结果均在中国药典要求的50-200%的可接受范围内，并满足干扰测试要求。研究数据还用于支持中国药典在其最新更新中将rFC方法纳入BET。

Muroietal，比较了LAL和rFC测定法在具有复杂基质的人体疫苗的内毒素检测。该研究比较了四种不同的检测方法：两种LAL检测方法和两种基于rFC的检测方法。测试的药品包括：

1）含有蛋白酶的减毒活病毒疫苗；

2）对内毒素检测没有干扰的灭活病毒疫苗；

3）可能含有来自其所含革兰氏阴性抗原的天然内毒素成分的一种灭活疫苗；

4）具有红色的灭活病毒疫苗，可能干扰经典LAL显色动力学测定中的黄色终点判定。

结果表明，基于rFC的内毒素检测方法适用于四种不同基质特征的产品中的内毒素检测。所有方法的参考标准均是要求内毒素(RSE)加标回收率(100EU/ml)在50–200%范围内。该研究得出结论，LAL和rFC检测都足以测试和放行四种疫苗产品。

随着科学的进步，重组生产的治疗性蛋白质和肽类药物已经系统地取代了动物提取物。蛋白质的天然提取物和重组蛋白在功能、效用上的等同性是生物技术革命的基础。因此rFC的发展不是对LAL的挑战，而是对LAL的传承与创新。另外，rFC法能够消除与鲎试剂相关的许多制约性，例如批次间的变异性；rFC试剂的主要原材料是基因重组表达生产，可稳定的大批量持久供应，不受天然原材料来源的限制；rFC法的使用也符合3R 原则（替换、减少、改进），这将为动物和人类带来持久的利益。因此未来几年内，rFC法有望成为替代LAL的主流内毒素检测法而被纳入各国药典正式方法。

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参考文献

[1] Tindall,B.,Demircioglu, D., & Uhlig, T. (2021). Recombinant bacterial endotoxin testing: a proven solution. BioTechniques, 70(5), 290-300.